免费申请试用装服务与支持
以专业技术能力，为您带来更好的产品服务
1. PCR原理
PCR是一种能够在短时间内实现将单个DNA分子扩增数百万倍的生化过程。其扩增过程包括三个连续步骤：变性，退火，延伸。
2. 设计引物需要考虑的参数
引物是决定PCR反应成败的最重要因素之一。
引物设计主要考虑因素为：特异性和扩增效率。
Ø 特异性是由错配的频率决定。特异性差的引物易产生不需要的扩增产物。
Ø 扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物的最优能力。
引物 | 原则 |
长度 | 引物的最佳长度为24或25个碱基左右。但是如果需要调整Tm值，引物的长度可以控制在21至28个碱基之间。当扩增≥10 kb长片段时，25- 35个碱基之间的引物可以提供更好的结果。 |
碱基含量 | GC含量含量为40% -60%为宜。 |
3’端 | 如果引物过短，在3’端具有四个G和/或C碱基可能会有帮助，尤其是用于扩增样品中的所有cDNA或gDNA的通用引物，但添加这些碱基可能增加基因特异性引物的非特异性扩增。 特别注意引物不能互补，尤其是在3’末端，防止一对引物内的同源性。 自身互补性（如，在上游引物内）可导致发夹结构的形成，发夹结构可在茎部有四个G/C碱基对和环内有三个碱基时形成。 注意: PCR的产量通常取决于PCR引物的3’端。引物间形成二聚体会降低扩增效率。 |
Tm | 如果按公式Tm=4℃*（G+C）+2℃*（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为68-70℃。 设计引物的Tm值在68-70℃之间。虽然这不是绝对必要的，但是使用严格的PCR条件（如：“touchdown PCR”和“两步法PCR”）可以提高引物的特异性。 |
序列特异性 | 引物应该对要扩增的目的基因有特异性。 BLAST搜索可以用来寻找同源性区域。 |
重复碱基 | 引物中二核苷酸重复的最大次数为4次(如ATATATAT)。 |
Runs | 避免长的单个碱基（大于3个）重复序列，否则可能造成移码或错配。 |
3. 计算引物的Tm值
引物用Tm值来评价DNA-DNA杂交链稳定性，过高的退火温度会导致引物-模板杂交不足，导致PCR产物产率低，而退火温度过低可能导致非特异性产物扩增。
不超过20个碱基的引物Tm值计算使用如下Wallace法则：Tm = 2℃ (A+T) + 4℃ (G+C)
超过20个碱基的引物Tm值计算可使用引物设计软件，比如Primer3。
4. 引物使用原则
PCR反应使用的引物纯化：
标准脱盐引物能满足大多数PCR应用。
PCR反应使用的引物浓度：
每种引物的PCR反应最终浓度应在0.1至0.5 μM之间。
注：过高的引物浓度会增加错配的可能，这可能导致非特异性扩增。过低的引物浓度则可能导致扩增效率低。
简并性引物对PCR扩增的影响：
通常一条引物中简并的碱基不要超过4处。
注：简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效引物相对的较少，应适当增加引物的使用量。但引物量过大，容易引起非特异扩增。
5. PCR反应的最适模板添加量
通常最适模板添加量取决于模板的复杂程度和目的基因拷贝数。25-30个循环，可以检测到约104拷贝的目的基因序列。
DNA | 分子数 | 模板推荐量 |
1 μg人类基因组 | 约3.04 x 105 DNA分子 | 30-100 ng |
1 μg大肠杆菌基因组 | 约2 x 108 DNA分子 | 100 pg-1 ng |
1 μgλDNA | 1.9 x 1010 DNA分子 | 100 pg-500 pg |
cDNA | -- | >10pg |
注：高拷贝的目的序列（如管家基因），只需10 ng的模板。
复杂模板添加量范围在10 ng至500 ng之间。
非所有的聚合酶都能耐受过量的模板。
6. 高GC模板的PCR扩增需要注意什么？
Ø GC含量超过65%的模板被认为是GC-rich模板。
Ø 高GC的基因序列区域容易形成反向重复，或发夹结构，使PCR退火过程不能顺利进行。因此，高GC会使DNA链分离效率低，导致GC-rich模板的扩增比较困难。
Ø 使用Tm值较高的引物(>68℃)，因为退火可以在较高的温度下进行。
扩增高GC模板需注意：
l 使用较高的变性温度(如98℃，而非94℃或95℃)，以允许模板完全变性。
l 尽量缩短高GC模板的退火时间。
通过向反应中添加DMSO，可以提高GC模板或复杂模板的扩增效果。DMSO的推荐终浓度在1%到5%之间。相反，有些模板可能有很长的AT-rich延伸序列，在标准反应条件下很难扩增，可以使用较低的延伸温度（如，延伸温度从72℃降至65-60℃,DNA仍可扩增）。
7. 长DNA片段扩增需注意哪些因素？
模板质量：
DNA完整性对于长DNA片段的扩增非常重要。DNA损伤（如DNA断裂、DNA脱嘌呤）导致产生大量不完整扩增产物，降低扩增量。
PCR条件：
l 变性时间应保持在最低限度，以减少脱嘌呤。
l 使用touchdown PCR：在较高的退火温度下开始，持续几个循环以后，每循环减少1-2℃退火温度。
l 设计Tm值高于68℃的引物。
8. 如何优化PCR反应？
预变性：
有时需要预热使复杂模板变性（如基因组DNA）。通常94℃一分钟足以使其变性。过度热处理可能会降低酶活性或使酶失活。
变性：
应根据您选择的酶试剂选择变性条件，通常使用94-95℃，30秒或98℃，10秒。
注：温度过高或变性时间过长可能会导致酶失活和/或长片段模板的损伤
退火:
退火条件应针对每对引物的Tm值进行优化。
注：使用过低的退火温度可能导致错配和非特异性扩增，从而导致目的产物收率较低。
过长的退火时间可能会导致错配--诱导的非特异性扩增。
延伸:
一般来说，建议延伸时间为30-60 sec/kb。
注：扩增小于1 kb DNA时，推荐使用三步法PCR。
高GC序列或长片段扩增(>10 kb)，推荐采用两步法PCR。
9. PCR反应选择两步法，还是选择三步法？
两步法PCR包括变性和合并退火/延伸步骤。当引物Tm值接近延伸温度（72℃）或稍低一些，考虑使用两步法PCR。
三步法PCR包括变性、退火和延伸步骤。当引物的Tm值低于延伸温度或小于68℃时，推荐使用三步法。
10. 使用PCR酶时应注意哪些方面？
使用目的：
普通Taq DNA聚合酶保真度较低，扩增复制的模板，通常直接用以检测，不用于克隆构建。
高保真DNA聚合酶的保真度较高，能够准确复制模板，或者在引物的3'端加入正确的核苷酸，产生平末端产物，具有校正活性。通常被用于基因克隆、蛋白质表达、蛋白质结构功能研究、cDNA文库构建和下一代测序。
使用过程：
每次取酶时，必须使用一个新的、干净的枪头。
吸取酶时，将枪头的末端置于液体中合适的位置，使其能刚好获得所需的酶量。
注：枪头的尖端不应完全浸入酶溶液中，因为尖端的外部会被酶粘附，从而妨碍了准确量取并且会浪费酶。
11. 如何将平滑末端PCR产物克隆到TA克隆载体中？
Ø 纯化PCR产物。在添加A尾之前，用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，去除反应中所有的聚合酶是非常重要的。
注：任何残留的DNA聚合酶的校正活性都会降解A尾。
Ø 加A反应体系
名称 | 体积（μl） |
纯化后的PCR产物 | 若干 |
dATP (10 mM) | 1 |
10X PCR buffer with Mg2+ | 5 |
Taq DNA polymerase (5 U/μl) | 0.2 |
ddH2O | To 50μl |
Ø 在72℃孵育30分钟，纯化回收后进行TA克隆。
注：为了获得最佳的连接效率，最好使用新鲜的PCR产物，长时间保存会使3’端A尾会逐渐消失。
12. PCR引入突变有哪些因素？
DNA聚合酶可以引入不同类型的突变，包括单碱基替换、缺失和插入。碱基替换通常是由DNA合成过程中不正确的dNTP的错误插入引起的。突变的频率可能与序列有关。
l 不平衡dNTP浓度：浓度不一致的四种dNTPs可以增加8倍的碱基替换可能。
l 高的酶浓度
l 长时间孵育
l 缺少3'→5'外切酶活性
l 镁离子浓度：当Mg2+浓度与dNTPs总浓度相等时，保真度最高。保真度随着游离的二价阳离子浓度的增加而降低。
l 反应pH：反应体系的pH值降低3个单位可以使碱基替换量增加60倍（低pH值(<6.0)可导致自发性嘌呤遗失）。
l DNA损伤 ：DNA损伤可以在高温下发生，可能会增加突变的速度。一个常见的突变是胞嘧啶脱氨生成尿嘧啶。
l 引物序列中存在的A延伸
l 过度循环：在最终的PCR循环中，DNA浓度增加时，错误率增加。总循环数应保持在最低限度，以扩增出正确目的PCR产物。
13. PCR过度循环?
PCR过度循环是指循环超过扩增的指数阶段。
发生过度循环的因素：
l 底物耗竭(dNTPs或引物)
l 试剂在变性温度下不再稳定
l PCR聚合酶受到产物(焦磷酸盐、双链DNA)的抑制
l 非特异性产物对试剂(dNTPs和引物)的竞争
l 反应的pH值降低
l 产物在高浓度下的不完全变性/链分离等
琼脂糖凝胶上检测显示：PCR过度循环产物出现强烈的拖尾，条带难以区分。建议进行预试验，以确定生产足够产物所需的最少PCR循环数。
14. 如果存在非特异性扩增条带，如何提高产物特异性？
Ø 使用BLAST确定引物的3’端是否有与目标位点以外的位点互补，可重新设计引物或调整PCR条件。
Ø 完善PCR反应条件：设置梯度退火温度和退火时间；减少PCR循环数；使用touchdown PCR；改为两步法PCR
Ø 调整模板用量
15. 如果PCR产生错误，应该怎么办？
为了避免PCR过程中的错误，建议使用高保真酶。
避免以下影响因素：
过度循环：过度循环PCR反应经常会出现。
注：影响pH值，导致错误的发生
增加PCR产物的量，从而降低聚合酶的效率，导致错误的发生
降低了dNTP的数量，体系中不用浓度的dNTP导致的碱基配对错误的可能性。
Mg2+浓度过高：使用高浓度的Mg2+可以提高产量，但也会影响酶的校正活性。PCR体系中Mg2+浓度应该始终高于dNTP浓度。
模板DNA损伤：在分析或切胶回收PCR产物时，尽量缩短紫外线照射时间。
16. PCR扩增无目的条带产生的原因?
PCR反应的关键环节：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量；④PCR条件。
模板：
a．模板中含有杂蛋白质，特别是染色体中的组蛋白。b．模板中含有Taq酶抑制剂。c．模板核酸变性不彻底。d．选择质量可靠的提取试剂。e．靶序列变异。
如靶序列发生突变，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，导致PCR不能有效扩增。
引物：
a．引物设计不合理，如引物长度不够、引物之间形成二聚体等，需要重新设计引物。
b．合成高质量、高纯度级别的引物。c．引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期4℃保存，导致引物降解失效。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或活性降低而导致没有产物。
PCR条件：
a．PCR扩增条件：变性对PCR扩增相当重要，如变性温度低、变性时间短都有可能出现扩增无产物；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。b．Mg2+浓度：Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高会降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败。c．反应体系：通常在进行PCR时需要先摸索条件。
17. PCR产物电泳出现拖尾现象（“Smear”），该如何改善结果？
使用阳性和阴性（无模板）对照来确定拖尾的来源。如果阴性对照为空白，则无污染。如果阴性对照也出现拖尾，则存在污染，需要确定这种污染的来源。
引物设计不合理或PCR条件不理想产生的，或过度循环产生。
优化以下条件：a. 减少模板添加量；b. 提高退火温度；c. 使用touchdown PCR；d. 减少PCR循环数；e.重新设计引物；d.重新扩增PCR产物。
18. PCR扩增出现假阳性的原因?
假阳性条带与目的序列条带大小一致，有时其条带更整齐，亮度更高，
原因：
引物设计不合理：a．选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，扩增出的PCR产物为非目的性序列。b．靶序列或引物太短，出现假阳性。
出现污染：a．交叉污染。b．空气中的核酸污染。
19. 如何进行污染检测？
须设计对照实验
阳性对照：PCR反应都应设有PCR阳性对照。
注：阳性对照是重组质粒及高浓度阳性样品，添加量不要过多。
阳性对照对检测或扩增样品污染的可能性很大，操作时一定要分区操作。
阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照，即在PCR试剂中不填加模板DNA或RNA，直接进行PCR扩增，从PCR扩增的结果判断试剂是否有污染。
引物：选择不同区域的引物进行PCR扩增，排除引物还是其他试剂的污染。
微信扫码咨询
