1. 无缝克隆

基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平操作，通过DNA片段与线性化载体末端15~25 nt同源序列的重组，可将DNA片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。

原理如下：

无缝克隆通过T5核酸外切酶沿5’→3’方向降解dsDNA，产生黏性末端，但T5外切酶并不能保证切割出5’端都一样长的粘性末端。在退火之后，无缝克隆中的DNA聚合酶会针对缺失的碱基进行添加，Taq连接酶催化碱基之间形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐。

具体实验流程如下：

2. 无缝克隆与传统酶切克隆的比较

相比传统的酶切克隆，无缝克隆更便捷更灵活，不受酶切位点限制，可以在质粒的任何位点进行一个或多个DNA片段的插入。

3. 设计引物需要考虑的因素

引物是决定PCR反应和克隆反应成败的最重要因素之一。在基因克隆的引物设计及DNA片段的扩增阶段，与常规 PCR相同。差异在于载体末端和引物末端应具有 15～25nt同源序列，由此得到的PCR产物两端分别带上15～25个与载体序列同源性的碱基。

Ø  特异性是由错配的频率决定。特异性差的引物易产生不需要的扩增产物。

Ø  扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物的最优能力。

Ø  重组效率指成功获得含有插入片段的克隆概率。

单插入片段引物设计公式：

5’-上游载体末端同源序列+酶切位点（可删除）+目的基因特异性正向配对序列-3’

                    5’-下游载体末端同源序列+酶切位点（可删除）+目的基因特异性反向配对序列-3’

多插入片段引物设计公式：

5’-上游载体末端同源序列+酶切位点（可删除）+目的基因特异性正向配对序列-3’

5’-前一片段末端同源序列+后一片段目的基因特异性正向配对序列-3’或5’-后一片段同源序列+前一片段特异性反向配对序列-3’

                    5’-下游载体末端同源序列+酶切位点（可删除）+目的基因特异性反向配对序列-3’

4. 载体与插入片段的获取方式

线性化载体:

Ø  选择合适酶切位点，进行单酶切或双酶切处理，胶回收获取线性化载体；

Ø  在载体上设计反向PCR扩增引物，对载体进行反向扩增，胶回收获取线性化载体。

注：

酶切位点建议选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆，当酶切位点25 nt区域内含量为40~60%时，重组效率最高。

载体酶切一定要完全，否则未切开的载体会影响后续阳性克隆的鉴定。

经双酶切进行线性化无需去磷酸化，经单酶切则建议去磷酸化，防止载体自连影响重组反应，导致克隆失败或阳性克隆率下降。

插入片段：

Ø  设计特异性引物，以质粒、基因组DNA或cDNA进行PCR扩增目的基因，PCR产物纯化回收或胶回收获取插入片段。

注：

推荐使用高保真的聚合酶进行扩增，以减少扩增突变的引入。

若PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积应不超过总反应体积的20%。

5. 克隆失败或阳性率低的优化

Ø  引物设计不正确：具体设计参见引物设计原则，重新设计引物。

Ø  载体线性化：载体线性化不完全可直接影响重组反应，建议增加限制性内切酶用量，延长酶切时间，使用胶回收纯化酶切产物。重组反应载体加入量过少，引起克隆失败，建议增加反应中线性化载体量。制备的载体中含有重组反应抑制物，抑制反应，建议线性化载体进行胶回收纯化，纯化产物用ddH2O洗脱。

Ø  插入片段：以质粒、基因组DNA或cDNA为模板进行扩增时，使用高保真的聚合酶进行扩增，以减少扩增突变的引入。以质粒为模板进行PCR扩增时，可以使用已经线性化的质粒作为模板。对PCR产物进行胶回收纯化，防止杂质粒污染及非特异性产物的不正确插入。建议插入片段回收用ddH2O洗脱。

Ø  DNA片段比例不佳：载体与插入片段的加入比例影响重组反应，建议按照试剂说明书推荐的最适用量和比例配制反应体系。

Ø  感受态效率：感受态细胞转化效率应大于10⁸cfu/μg，且加入重组产物的量需要小于等于感受态细胞体积的十分之一。