1. qPCR原理

利用实时荧光信号的变化监测整个PCR进程，对未知模板进行定量分析的方法，主要分为染料法荧光定量检测和探针法荧光定量检测。其特点有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等，不仅应用于基因表达解析，还被广泛应用于SNP分型解析、病毒和病原菌的检测、物种鉴定、转基因食品的定量分析等诸多领域。

基线期：PCR反应早期，循环数较少，产物累积较少，产生的荧光的水平不能与荧光本底背景明显区分。

平台期：PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是以指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。

Ct值（Cycle threshold）：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系，因此，通过已知浓度样品的Ct值和未知浓度样品的Ct值，可以计算求出未知样品的起始模板量。

熔解曲线（Melt curve）：检测是荧光强度与温度的变化，可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。

决定系数（r Squared）：反映标准曲线的直线性，越接近于1说明直线性越好，定量越准确。

斜率（Slope）：反映PCR扩增效率，-0.25～-0.33（根据不同装置数值不同）。
扩增效率（Efficiency）：理想情况下扩增效率应在0.8﹤E﹤1.2。

2. 染料法荧光定量和探针法荧光定量的比较

3. 绝对定量与相对定量

绝对定量：使用已知拷贝数的绝对标准品，制作标准曲线，对未知样品的绝对量（拷贝数）进行测定的方法；通常应用于在病毒、细菌、衣原体、支原体及转基因食品的检测中应用广泛。

作为标准品应尽量选择与实际检测样品结构近似的样品，以基因组DNA为起始材料时需选择基因组DNA作为标准品；进行mRNA表达解析时需选择表达目的基因的总RNA或逆转获得的cDNA作为标准品，但在绝对定量推荐使用RNA梯度稀释后进行逆转录和qPCR的标准曲线制作。

相对定量：是分别测定目的基因和参比基因（内参基因）的量，再求出对于参比基因的目的基因的相对量，进行样品间相对量的比较。主要用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片、基因过表达或siRNA干扰的实验结果。

4. 荧光定量引物设计原则

5. TaqMan探针常用荧光-淬灭对

探针法通常是使用5’端带有荧光物质（如：FAM等）, 3’端带有淬灭物质（如：TAMRA、BHQ等）的探针进行荧光检测的方法。

6. 如何选择Two Step RT-PCR和One Step RT-PCR？

基因表达解析等绝大部分RT-PCR，建议选择Two Step RT-PCR。可选择随机引物、OligodT或基因特异性引物进行逆转录反应，然后再将反转录反应液（cDNA）或稀释后作为模板进行RT-qPCR。

RNA病毒检测等RT-PCR，建议选择One Step RT-PCR，反转录反应引物只能使用基因的特异性PCR下游引物。其逆转录反应和PCR反应在同一反应体系内进行，操作简便，降低污染。但这一反应体系并非逆转录反应和PCR反应的最佳反应条件，因此，One Step RT-PCR要比Two Step RT-PCR反应效率低。

7. 总RNA中混有基因组DNA时处理方法

Ø  引物设计在Exon junction或长内含子侧翼上，避免基因组DNA扩增。引物选择跨越较长的内含子，在这个内含子两侧的外显子上分别设计上、下游引物。

Ø  使用DNase I处理去除基因组DNA污染：使用常规方法提取Total RNA后，再使用DNase I处理。

Ø  可选用使用ExonScript RT SuperMix with dsDNase 逆转录试剂盒，可以高效去除残留的基因组DNA。去除基因组DNA和逆转录反应在同一管内完成。

8. 荧光定量实验成功的关键要素

Ø  总RNA需通过电泳和OD分析确认其质量，再逆转录获取cDNA。建议实验室设置阳性对照与阴性对照。

Ø  引物和探针的设计：参见4.荧光定量引物设计原则

Ø  选择优良试剂：根据实验目的选择染料法荧光定量检测或探针法荧光定量检测；为了减少操作错误，建议选择2×预混试剂；为了降低非特异性扩增，最好选择Hot Start DNA聚合酶的预混试剂，但需在PCR条件的最初步骤设置10～15分钟的热变性程序，以恢复DNA聚合酶的活性；选用试剂耗材需与荧光定量检测仪配套；选择质量较高的标准品制备标准曲线。

Ø  反应条件的优化：可根据使用的产品说明书进行反应条件的优化。

Ø  实验操作：必须分区操作，避免污染。

9.  扩增曲线的荧光信号值低的原因

扩增曲线存在问题，如扩增曲线的荧光信号值低，通常是由于背景荧光信号值过高造成的。染料法进行检测时，背景荧光信号偏高大多数是由于模板量过高；荧光探针法进行检测时，背景荧光信号偏高大多是因设计的探针质量差

Ø  确认基线或ROX校正前的原始曲线。

Ø  调整模板使用量。

10.  扩增曲线出现朝右下方下落的原因

Ø  使用的模板量过多，扩增曲线过早起峰，使基线校正不能正常进行。建议优化模板使用量。

Ø  基线校正不恰当，确认设置的基线校正范围的参数。

11.  PCR扩增效率低的原因

Ø  PCR阻害物质的混入，需重新优化获取模板的方法。

Ø  标准品稀释不准确，需使用专用标准品稀释液。

Ø  PCR反应条件不佳。引物、试剂、PCR反应条件等优化。

12.  融解曲线出现复数峰的原因

可能是目的片段以外的扩增或引物二聚体的产生

Ø  存在目的基因的Variants，需重新设计引物。

Ø  引物二聚体等非特异性扩增，优化PCR条件或重新设计引物。

Ø  基因组DNA的扩增，需用DNase I处理或考虑重新设计引物。

注：建议对初次使用引物的扩增产物进行电泳确认：单一峰型时可以确认扩增片段大小，判断是否为目的产物；非单一峰型时也有必要对扩增产物进行确认，如果电泳结果显示为单一条带，并与目的片段大小吻合，可以判断为进行了特异性扩增。

13.  Ct值的计算方法

Ø  交点法，通过荧光阈值和扩增曲线的交点获得Ct值。

Ø  二次求导法，通过扩增曲线二次求导后取其最大值获取Ct值，其不会随荧光阈值的设定不同而变化，重现性高。

14.   RT-qPCR预混试剂有絮状沉淀物的处理方法

白色絮状沉淀物的产生有时是由组分溶解不彻底导致。此时请用手稍微加热或室温短时间放置制品，然后进行上下颠倒或低速短暂涡旋混合，使组分充分溶解，但请不要用振荡器等剧烈搅拌混合。溶解后的试剂性能不受影响。

15.  使用qPCR试剂时，PCR程序选择两步法还是三步法

普通PCR反应程序按三步法进行，而qPCR系列产品的大量实验数据表明，两步法PCR可以减少反应时间，增强反应特异性，提高扩增效率，得到较好的实验结果，推荐使用标准程序两步法PCR。即退火/延伸温度为60℃，可在60～66℃范围进行优化。但需要注意避免退火/延伸设定温度高于68℃，温度过高引物退火不完全，降低扩增效率。如果两步法PCR反应性能较差时，可使用三步法PCR程序进行优化。